Ordenen var opdelt i otte ”Tunger” efter de nationer, hvorfra hovedparten af ridderne kom: Aragonien, Castilien, Frankrig, Auvergne, Provence, Italien, Tyskland og England.

Da det nu var en ø-stat, Ordnen skulle forsvare, opbyggedes en efter tidens forhold betydelig flåde, der hovedsagelig bestod af galejer; denne flåde skulle i de kommende århundreder blive en betydelig magtfaktor i det østlige Middelhav.  Men ved siden af dette, som den hårde nød-vendighed krævede, blev det aldrig glemt, at Ordenen i sin oprindelse var en gejstlig præget hospitals- og barmhjertighedsorden - og alle, som søgte optagelse i Ordenen, fik meget grundig belæring om, hvad der var Ordenens oprindelige formål.
Om end ridderne ikke blev forskånet for kamp og strid, blev der naturligvis ikke kæmpet hver dag, men hospitals- og barmhjertighedsarbejdet skulle desuagtet udøves hver eneste dag!
(Bemærk, at i Mellemøsten stod den lægelige viden i datiden langt over Vesteuropas, og Ordenens folk kunne her samle lærdom fra alle samtidens tilgængelige kilder.)

 

Ordenens stilling på Rhodos blev stedse mere og mere udsat, efterhånden som de kristne blev fortrængt fra det østlige Middelhav: Det Østromerske Kejserrige og selveste Konstantinopel faldt, og muslimerne beherskede efterhånden hele Balkan, ja de kunne også true kejserstaden Wien. Til slut var den eneste kristne bastion så Johanniterordenen på Rhodos.                                                                                                                                                                                                                                                    
I 1522 besluttede den mægtige sultan Soleyman  at fordrive Ordenen fra Rhodos, og han indledte et angreb med en overvældende angrebs- og belejringsstyrke. Ridderne forsvarede sig hårdnakket, og nu fulgte en langvarig belejring af Rhodos By. Fra de kristne riger i Vesteuropa kom ingen hjælp, og ved årets udgang var situationen så håbløs, at al tapperhed, mod og offervilje var nyttesløs. Ordenen måtte overgive sin lille ø-stat til sultanen, og den 1. Januar 1523 drog man på ny i eksil.

 

Ordensridderne havde dog forsvaret sig så hæderfuldt, at den barske sultan tillod Ordenen en ærefuld kapitulation: Ordenen kunne forlade Rhodos under fuld honnør med alle våben, regalier og de helgenrelikvier, man var i besiddelse af; endvidere fik Ordenens hjælpetropper samt kvinder og børn lov til at forlade Rhodos.    Billede Ridderborg på Rhodos.                                             

 

På ny så det ud som om Ordenen stod overfor sin undergang; ganske vist havde man besiddelser i mange lande, men skulle man udfylde sit formål, måtte man have et hovedsæde.
Da formålet var både barmhjertighedsarbejde og kampen mod de vantro, kunne man vanskeligt tænke sig et andet område end Middelhavet, hvor Ordenen kunne være suveræn; galejflåden var jo intakt.
Stormester l’Isle Adams formåede her det utrolige, idet han i 1530 udvirkede kejser Karv V’s  overdragelse af øen Malta med omliggende øer.