Ordenen var opdelt i otte ”Tunger” efter de nationer, hvorfra hovedparten af ridderne kom: Aragonien, Castilien, Frankrig, Auvergne, Provence, Italien, Tyskland og England.
Da det nu var en ø-stat, Ordnen skulle forsvare, opbyggedes en efter tidens forhold betydelig flåde, der hovedsagelig bestod af galejer; denne flåde skulle i de kommende århundreder blive en betydelig magtfaktor i det østlige Middelhav. Men ved siden af dette, som den hårde nød-vendighed krævede, blev det aldrig glemt, at Ordenen i sin oprindelse var en gejstlig præget hospitals- og barmhjertighedsorden - og alle, som søgte optagelse i Ordenen, fik meget grundig belæring om, hvad der var Ordenens oprindelige formål.
Om end ridderne ikke blev forskånet for kamp og strid, blev der naturligvis ikke kæmpet hver dag, men hospitals- og barmhjertighedsarbejdet skulle desuagtet udøves hver eneste dag!
(Bemærk, at i Mellemøsten stod den lægelige viden i datiden langt over Vesteuropas, og Ordenens folk kunne her samle lærdom fra alle samtidens tilgængelige kilder.)
I 1522 besluttede den mægtige sultan Soleyman at fordrive Ordenen fra Rhodos, og han indledte et angreb med en overvældende angrebs- og belejringsstyrke. Ridderne forsvarede sig hårdnakket, og nu fulgte en langvarig belejring af Rhodos By. Fra de kristne riger i Vesteuropa kom ingen hjælp, og ved årets udgang var situationen så håbløs, at al tapperhed, mod og offervilje var nyttesløs. Ordenen måtte overgive sin lille ø-stat til sultanen, og den 1. Januar 1523 drog man på ny i eksil.
Da formålet var både barmhjertighedsarbejde og kampen mod de vantro, kunne man vanskeligt tænke sig et andet område end Middelhavet, hvor Ordenen kunne være suveræn; galejflåden var jo intakt.
Stormester l’Isle Adams formåede her det utrolige, idet han i 1530 udvirkede kejser Karv V’s overdragelse af øen Malta med omliggende øer.